胶体金平台-北京厚生正德科技有限公司

首页 ꄲ 胶体金平台

胶体金免疫层析技术平台

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种较成熟的免疫标记技术。由于其成本低、使用方便、快速读取结果等特性，被广泛得应用于POCT、食品安全等领域。

胶体金技术的发展

1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的分布

1975年 Horisberger等把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究

1978年 Geoghegan 发表了胶体金标记物在光镜水平的应用

1981年 Danscher 建立了银显影液增强，光镜下金颗粒可见性的方法

1983年 Moeremans等在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法

1986年 Fritz等在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色

纳米金性质

纳米金（nanogold）也称为胶体金（colloidal gold），是金盐（HAuCl4）被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，具有胶体的多种特性。如图1.9所示，纳米金颗粒由一个基础金核（原子金周围包含有11个金原子的二十面体）及包围在外的双离子层（又称为水化膜）构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间的溶液中。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zeta电位，可以使纳米金颗粒之间相互排斥，以维持胶体的稳定状态.，纳米金还具有胶体的其他特性，特别是对电解质的敏感性。高浓度亲水性电解质能破坏纳米金颗粒外周的水化膜，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒而从液体中沉淀下来。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。

纳米金颗粒示意图

胶体金标记技术

纳米金标记的过程实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。纳米金与抗体结合的机制尚未十分清楚，大多数学者认为纳米金颗粒与蛋白的结合是一种物理吸附性过程：金颗粒表面带负电荷，蛋白质分子表面带正电荷，两者靠静电引力相互吸引，达到范德华引力范围内即形成牢固的结合。另一种观点则认为抗体是通过三个作用力与纳米金相结合的，

胶体金标记技术的优势

纳米金标记技术是四大免疫标记技术之一，与其他三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）相比，用于小分子检测有以下优势：(1)纳米金易制备，价格低廉，成本较低；(2)纳米金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，同时检测多种物质；(3)纳米金本身有鲜艳的颜色，检测结果直接用颜色显示，肉眼容易判断，无需仪器设备，结果直观可靠，特别适合于现场检测；(4)简化了烦琐的常规操作过程，大大缩短了检测时间，同时也减小了因操作引起的误差。

胶体金免疫层析技术的优势

与其他方法相比，纳米金免疫层析方法具有以下优势：

(1) 快速，一次试验只需 5～15min，加样、反应和洗涤均通过层析完成，提高了检测速度；

(2) 简便，单一试剂，一步操作，不需要荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，试验可以在任何地方进行，更适合于现场应用；

(3) 方便、实用，既可单份测定又可批量检测，操作简单易学，结果直观易读；

(4) 安全可靠，没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质的参与，试剂安全无毒；

(5) 结果稳定，与荧光素、酶标记不同，纳米金的颜色不受时间和光照的影响，实验结果可长期保存；

(6) 试剂稳定，全部试剂可在室温长期保存。

胶体金免疫层析技术的原理

纳米金免疫层析试纸条的结构

纳米金免疫层析试纸条是由吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫相互交叠粘附于聚氯乙烯（Polyvinylchlori, PVC）衬板上组成（见图1.13）。其中硝酸纤维素膜上通常包被两条线，质控线（C线）和检测线（T线）。根据所采用的原理不同，检测线和质控线的成分也不同。

试纸条结构示意图

Fig. 1.13 Sketch map of test strip

原理

从抗原、抗体反应的原理上可以把免疫层析法分为以下三种主要类型：双抗体夹心法、间接法、竞争抑制法。

(1) 双抗体夹心法

双抗体夹心法（double antibody sandwich format）主要用于检测比较大的生物分子及颗粒性抗原（细菌、病毒、蛋白质和LPS等）。大的抗原分子有多个抗原位点，根据不同情况可以采用单抗和多抗配对或单抗和单抗配对检测。单抗配对时应采用两株针对不同抗原位点的抗体进行分析，针对的位点相距越远，其单抗配对检测的效果越好。也有人认为如果抗原拥有多个相同的位点用于结合抗体的话，可用同一株单抗制备双抗体夹心试剂。如图1.14所示。金标为鼠源抗待检大分子单克隆抗体-1（MAb-1）与纳米金的复合物，检测线包被鼠源抗待检大分子MAb-2，质控线包被羊抗鼠IgG。当待检样品中含有一定量的待检大分子时，样本通过层析作用到达金标垫位置，待检大分子和金标抗体发生反应，再泳动至检测线位置，与检测线上包被的MAb-2发生反应，形成双抗体夹心复合物，这样就把金标抗体通过待检分子桥连到检测线上，达到一定量后，金标显色为肉眼可见的水平，多余的金标抗体继续泳动到质控线位置，与羊抗鼠IgG发生反应而显色，这样就得到阳性结果。检测线的颜色与样品中待检大分子的含量成正比。样品中不含待检大分子时，金标复合物不能被检测线上的MAb-2截留而不显色，只有质控线显色，这样就得到了阴性结果。当检测线和质控线均不显色时，表示试纸条无效。

(2) 间接法

间接法主要用于抗体检测，以禽流感病毒（AIV）抗体的检测为例，其反应原理如图1.15所示。将纳米金标记的鼠抗鸡抗体固定于金标结合垫上，检测线为AIV核蛋白（NP），质控线为羊抗鼠抗体。检测时，鸡血清样品中的AIV抗体与纳米金标记鼠抗鸡抗体结合后被检测线上的NP捕获而显色，检测线的颜色与样品中AIV抗体的量成正比。同样若质控线不显色，判为失效

(3) 竞争抑制法

免疫层析技术应用于小分子检测时，因为小分子不能同时结合一个以上的抗体，所以一般采用竞争抑制法，以黄曲霉毒素检测为例说明其原理，如图1.16所示：样品滴加到试纸条下端的样品垫上后，样品通过毛细管作用沿试纸条向吸水垫方向泳动，被溶解的金标抗体与样品中的黄曲霉毒素结合，当样品和金标抗体的混和液泳动至检测线时，未与样品中黄曲霉毒素结合的金标抗体与检测线上的抗原（AFB1-BSA）结合，金标抗体堆积形成红色或浅红色T线，而未与检测线上抗原结合的金标抗体和金标抗体-黄曲霉毒素复合物继续泳动到质控线并与上面的第二抗体结合，堆积形成红色C线，若检测过程中C线没有出现颜色，表明检测无效样品中黄曲霉毒素的含量与检测线的颜色呈反相关，样品中抗原含量越高，T线的颜色越浅。