量子点免疫荧光组织化学

 

 

一、量子点免疫荧光组织化学原理量子点免疫荧光组织化学（Quantum Dots based Immunohistochemistry, QD-IHC）又称量子点免疫荧光细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，用量子点标记特异性抗体作为探针，检测组织或细胞中抗原性物质的一种技术。量子点免疫荧光组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以量子点标记一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和量子点标记二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。

 

 

量子点，又称为纳米晶，是一种由II－VI族或III－V族元素组成的纳米颗粒，其粒径介于1～10nm之间。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可发射荧光。它具有以下主要性质：(l)量子点的发射光谱可通过改变量子点的尺寸和化学组分来控制，波长覆盖整个可见光区；(2)量子点具有很好的光稳定性，与最常用的有机荧光材料“罗丹明6G”相比，其荧光强度高20倍，稳定性高100倍以上；(3)量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱，可以实现一元激发，多元发射，且多色量子点间不出现光谱交叠；(4)量子点具有较大的斯托克斯位移，可以避免发射光谱与激发光谱的重叠；(5)生物相容性好，量子点经过各种化学修饰之后，可以进行特异性标记；(6)量子点的荧光寿命长。有机荧光染料的荧光寿命一般仅为几纳秒(这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当），而量子点的荧光寿命可持续数十纳秒（20ns∽50ns)，这使得光激发后，大多数生物自发荧光已经衰变，而量子点荧光仍然存在，此时即可得到无背景干扰的荧光信号。

与传统的染料分子相比，量子点具有多种优势，是一种理想的荧光探针。比如可承受多次激发和光发射；持久的稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞和组织；量子点色彩丰富，可观察生物体系的复杂性。量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景。

 

图2量子点的组成及其性质

 

二、实验准备：1.标本准备

①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理

②冰冻组织切片：由病理室常规处理

③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。

2.试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。

②一抗与二抗

通常一抗有小鼠、大鼠、兔、人和豚鼠等动物源性；常规二抗包括羊抗鼠、羊抗兔、羊抗人、兔抗鼠、兔抗人等。

③量子点QD610nm

QD610nm激发波长为UV<400nm；发射波长610nm。

④其他试剂

二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠

3.抗体特异性验证

所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。

4.耗材准备

免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片

5.溶液配制

①磷酸盐缓冲液（PBS）

10×PBS母液配制

NaCl 72 g

Na2HPO4·12H2O 37.3 g

KH2PO4 4.3g

加蒸馏水至1000 ml，充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：

称取柠檬酸10.5 g，溶于500 ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O 57.3g，溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至6.0，即得2×母液，贮存备用。

③1%盐酸酒精

浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。

三、量子点免疫荧光组化操作步骤1.组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min。

②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min。

③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min。

④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。

⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。

2.抗原修复

将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。

注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！

3.封闭内源性过氧化氢酶

①放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min。

②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。

③放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min。

4.抗原抗体反应

①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 µl（根据组织大小调整用量），28℃放置20 min，甩干。

②直接法：加稀释好的量子点标记一抗；间接法：加稀释好的一抗1滴（20~50 µl，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4℃过夜。

③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。

④间接法：量子点标记的二抗20~50 µl（根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37℃放置20 min。

⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。

5.荧光显微镜下进行观察

将直接法与间接法荧光染色的切片至于荧光显微镜下观察，选择激发波长为UV<400nm，发射波长为600nm。

6.注意事项

①整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。

②组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。

四、结果判定1.阳性细胞判断

610nm量子点在荧光显微镜下呈红色。每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致，不能视为阳性。

2.抗原表达评价

免疫荧光强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，我们常用的免疫荧光组化评分方法如下：

定性：细胞免疫荧光强度评分：0（无荧光），1（弱荧光），2（中荧光），3（强荧光）；

定量：直接测定量子点的荧光强度。

肿瘤细胞阳性率评分：0（0~9%），1（10%~25%），2（26%~50%），3（51%~75%），4（76%~100%）

将荧光强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。