兔单克隆抗体研究进展及展望

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自鼠源杂交瘤技术问世以来，多种单克隆抗体（mAb）制备技术的出现使得鼠单克隆抗体在医学、生命科学、食品科学等领域得到了广泛应用。与鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体（RabmAbs）具有更高的亲和力，从而展现出更高的检测灵敏度以及对特定表位结构更强的特异性。本文综述了兔单克隆抗体的历史、制备技术、优缺点、当前应用以及未来展望。

【引言】

1975年，Köhler和Milstein发明了鼠源杂交瘤技术，标志着单克隆抗体在体外广泛应用的开端。目前，鼠单克隆抗体可用于临床诊断、食品安全检测等领域。然而，鼠单克隆抗体在临床应用中容易引发人抗小鼠抗体反应，导致抗体效力降低。因此，除了进一步开发新的小鼠单克隆抗体技术外，研究人员多年来一直在积极寻找其他模型动物。

1988年，Raybould等人使用聚乙二醇介导，将兔脾B细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14融合，获得了第一个兔-鼠杂合杂交瘤，但是存在遗传不稳定以及无法实现长期抗体分泌的问题。1995年，Spieker-Polet等人开发出第一个兔-兔同种杂交瘤，但Yam和Knight发现该细胞系存在两个主要问题：一是经过多次亚克隆后，杂交瘤逐渐失去了分泌抗体的能力；二是该细胞系本身表达了内源性兔IgG、IgM和IgA。1997年，Zhu等通过改进培养基和多次亚克隆，解决了遗传不稳定和内源性兔IgG分泌的问题，获得了更稳定且分泌效率更高的240E-W细胞系。2001年，Zhu等人进一步改进了融合细胞系，衍生出240E-W2和240-W3细胞系。广泛的融合实验表明，通过杂交瘤技术可制备出性能稳定的兔单克隆抗体，该技术2013年获得专利保护。

本文就兔单克隆抗体的发展历史、制备技术、优缺点、应用现状及发展趋势作一综述。

【主要内容】

1.兔单克隆抗体优势

兔B细胞抗体亲和力成熟既包含体细胞高频突变（SHM），也包含体细胞基因置换(GV)机制，而小鼠仅具有体细胞高频突变机制。抗体亲和力反映抗体分子与半抗原分子或抗原分子决定簇反应的能力，其大小可以用解离常数（KD）表示。由于兔独特的免疫亲和力成熟过程，研究发现RabmAbs的亲和力比鼠mAbs高10-100倍，其KD可达到皮摩尔水平。此外，相较于小鼠，兔具备更为完善的脂质及糖脂抗原呈递系统，这使得兔源抗体能够识别更广谱的抗原结合位点。Bystryn团队通过对比研究发现，具有人类免疫原性的抗原在小鼠模型中可能无法引发有效免疫应答，却能在兔免疫系统中被特异性识别。从免疫学机制分析，基因转换与体细胞高频突变使得兔源抗体库呈现高度多样性。针对相同免疫原，兔源抗体的表位识别丰度显著超越鼠源抗体，实验数据显示兔源抗体V区突变积累量较人类和小鼠高出约三分之二倍。这种独特的免疫进化机制有效弥补了种系基因数量的局限性，不仅大幅拓展了抗体库的多样性谱系，更赋予其对磷酸化肽段、碳水化合物及糖基化修饰等特殊抗原表位的精准识别能力。上述RabmAbs的生物学特性，为深入解析药物作用机制提供了新型研究工具与理论依据。此外，RabmAbs的半衰期比鼠mAbs长，且显示出较低的免疫原性。

人和鼠的免疫球蛋白可分为5类，即IgA、IgD、IgM、IgE和IgG，以及IgG的几个亚类（表1）。与鼠和人IgG不同，兔IgG仅有一种同种型，结构相对简单，且轻链多为κ链。此外，兔子IgG的重链可变区存在二硫键（图1），有助于增强抗体的稳定性。同时，兔的脾较大，融合的B淋巴细胞的数量是小鼠的大约50倍，可产生更多抗体。

表1.不同种属的IgG亚类

图1.兔、小鼠、鸡和人IgG示意图

2.兔单克隆抗体制备技术

2.1 杂交瘤技术

将兔骨髓瘤细胞与抗原免疫后的兔脾细胞或浆细胞融合，以获得能分泌抗体且可无限增殖的杂交瘤细胞，随后筛选出特定的细胞系，培养后可产生大量特异性RabmAbs。与鼠源杂交瘤相比，兔源杂交瘤同样不稳定，融合效率相对较低，耗时较长，且存在专利限制。

2.2 噬菌体展示技术

该技术通过将来自免疫兔的B细胞抗体基因序列插入噬菌体衣壳蛋白的结构基因中，使抗体与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，然后随着子噬菌体的扩增，融合蛋白组装并展示在噬菌体表面，可确保抗体的相对空间结构和生物活性。与杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术具有以下优势：一是能大规模筛选潜在目标抗体；二是可对现有抗体的抗原表位或构象进行修饰，以降低免疫原性并提高亲和力和稳定性；三是借助原核细胞的快速增殖和低成本培养，便于大规模制备高纯度抗体。然而，该技术也存在一定局限性：一是获得的抗体亲和力差，需要复杂的体外修饰；二是与杂交瘤技术相比，噬菌体抗体库筛选繁琐，阳性克隆率未显著提高；三是噬菌体抗体展示需经细菌转化和噬菌体包装，可能导致抗体的重链和轻链无法正确转录、翻译、修饰、折叠和组装。除噬菌体展示技术外，还有酵母、核糖体、细菌和哺乳动物细胞表面展示技术。

2.3 单B细胞技术

单B细胞抗体技术主要步骤如下：首先识别并分离特定的单个B细胞；然后进行Ig基因的单细胞扩增，并将Ig基因克隆到表达载体中；接下来在细菌系统或哺乳动物细胞系统中表达Ig基因，最后进行蛋白纯化并评估抗体性能。由于缺乏有效的表面标记，兔淋巴细胞的分离受到限制，因此为了选择用于单克隆抗体表达的抗原特异性兔B细胞，人们开发了多种新方法，包括荧光激活细胞分选（FACS）、淋巴细胞淘选、双色抗原染色法和基于芯片的免疫斑点阵列等。

3.兔单克隆抗体应用现状

由于RabmAbs的高特异性和亲和力，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准许多RabmAbs用于临床诊断应用，相关信息见表2。这些单克隆抗体有助于降低病理学检查对疾病的误诊率，提高患者的生存率，显示了RabmAbs较高的临床应用潜力。与肿瘤靶点特异性结合的治疗性抗体药物已成为生物制药的重要组成部分，具有显著的疗效，在疾病治疗中具有广阔的前景。目前，美国FDA已经批准了一些治疗性兔源性单克隆抗体的应用，相应的抗体药物信息见表3。同时，RabmAbs广泛用于检测食品中的有毒物质，在农药残留分析、农作物病原菌和病毒的诊断方面也具有重大的研究价值和应用意义。

表2.FDA批准用于临床诊断应用的兔单克隆抗体